RTL omgekeerde transkripsie
RTL omgekeerde transkriptase is 'n RNA-sjabloon-afhanklike DNA-polimerase wat nie die 3'→5'-eksonuklease-aktiwiteit het nie en RNase H-aktiwiteit het.Hierdie ensiem kan RNA as 'n templaat gebruik om 'n komplementêre string DNA te sintetiseer, wat toegepas kan word op eerste-string cDNA sintese, veral vir RT-LAMP (lus-gemedieerde isotermiese amplifikasie).In vergelyking met RTL omgekeerde transkriptase 1.0, is die sensitiwiteit aansienlik verbeter, die termiese stabiliteit is sterker en die reaksie by 65°C is meer stabiel.RTL omgekeerde transkriptase (gliserolvry) kan gebruik word om gevriesdroogde preparate, gevriesdroogde RT-LAMP reagense ens.
Eenheid Definisie
Een eenheid inkorporeer 1 nmol dTTP in suur-presipiteerbare materiaal in 20 minute by 50°C deur gebruik te maak van poly(A)•oligo(dT)25 as templaat-primer.
Komponente
| Komponent | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Omgekeerde Transkripsie (Gliserolvry) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL Buffer | 1,5 ml | 4×1,5 ml | 5×10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2×1,5 ml | 3×10 ml |
Berging Toestand
Vervoer onder 0°C en word gestoor by -25°C~-15°C.
Kwaliteitsbeheer
- Residuele aktiwiteit vanEndonuklease:'n 50 μL reaksie wat 1 μg λDNA en 15 eenhede RTL2.0 bevat wat vir 16 uur by 37 ℃ geïnkubeer is, toon dieselfde patroon as negatiewe beheer deur gelelektroforese.
- Residuele aktiwiteit vanEksonuklease:'n 50 μL reaksie wat 1 μg Hind Ⅲ verteerde λDNA bevat en 15 eenhede RTL2.0 wat vir 16 uur by 37 ℃ geïnkubeer is, toon dieselfde patroon as negatiewe beheer deur gelelektroforese.
- Residuele aktiwiteit vanNickase:'n 50 μL-reaksie wat 1 μg supergedraaide pBR322 en 15 eenhede RTL2.0 bevat wat vir 4 uur by 37°C geïnkubeer is, toon dieselfde patroon as negatiewe beheer deur gelelektroforese.
- Residuele aktiwiteit vanRNase:'n 10 μL reaksie wat 0.48 μg MS2 RNA en 15 eenhede RTL2.0 bevat wat vir 4 uur by 37°C geïnkubeer is, toon dieselfde patroon as negatiewe beheer deur gelelektroforese.
- E coli gDNA:Gemeet metE colispesifieke HCD-opsporingstelle, 15 eenhede van RTL2.0 bevat minder as 1E coligenoom.
Reaksie-opstelling
cDNA-sinteseprotokol
| Komponente | Volume |
| Sjabloon RNA a | opsioneel |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) of Random Primer-mengsel (60uM) | 2 μL |
| dNTP-mengsel (10 mM elk) | 1 μL |
| RNase-inhibeerder (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL omgekeerde transkripsie 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10×HC RTL Buffer | 2 μL |
| Nuklease-vrye water | Tot 20 μL |
Notas:
1) Die aanbevole dosis van Total RNA is 1ng~1μg
2) Die aanbevole dosis mRNA was 50ng~100ng
Termo-fietsry Toestande vir 'n roetine reaksie:
| Temperatuur (°C) | Tyd |
| 25 °Ca | 5 min |
| 55 °C | 10 minuteb |
| 80 °C | 10 minute |
Notas:
1) Indien Random Primer Mix gebruik word, 'n inkubasiestap by 25°C.
2) Indien teikenonderlaagmengsel gebruik word, 'n inkubasiestap by 55°C vir 10~30min.
RT-LAMP-protokol
| Komponente | Volume | Finale konsentrasie |
| Sjabloon RNA | opsioneel | ≥10 kopieë |
| dNTP-mengsel (10 mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| FIP/BIP Primers (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| F3/B3 Primers (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| LoopF/LoopB Primers (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| RNase-inhibeerder (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Reaksie |
| RTL omgekeerde transkripsie 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7.5 U/Reaksie |
| Bst V2 DNA Polimerase (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reaksie |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (Totaal 8 mM) |
| 10×HC RTL Buffer (of 10×HC Bst V2 Buffer) | 2,5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Nuklease-vrye water | Tot 25 μL | - |
Notas:
1) Meng deur te vortex en sentrifugeer kortliks om te versamel.Konstante temperatuur inkubasie by 65°C vir 1 uur.
2) Die twee buffers is interoperabel en het dieselfde samestelling.
Notas
1.Hierdie produk sal 'n wit vaste stof vorm wanneer dit by -20 °C gestoor word.Haal dit uit van -20°C en sit dit vir sowat 10 minute op ys.Nadat dit gesmelt is, kan dit gebruik word deur te skud en te meng.
2. Die cDNA-produk kan by -20°C of -80°C gestoor word of onmiddellik vir PCR-reaksie gebruik word.
3.Om RNase-besmetting te voorkom, hou asseblief die eksperimentele area skoon, en dra skoon handskoene en maskers tydens operasie.
