Proteïenase K NGS (poeier)
Kat nommer: HC4507A
NGS Protease K is 'n stabiele serienprotease met hoë ensiemaktiwiteit en wye substraatspesifisiteit. Die ensiem ontbind verkieslik esterbindings en peptiedbindings langs die C-terminaal van hidrofobiese aminosure, swaelbevattende aminosure en aromatiese aminosure.Dit word dus dikwels gebruik om proteïene in kort peptiede af te breek.NGS Protease K is 'n tipiese serienprotease met die Asp39-Syn69- Ser224katalitiese triade wat uniek is aan serienproteases, en die katalitiese sentrum word omring deur tow Ca2+bindingsplekke vir stabilisering, wat hoë ensiemaktiwiteit onder 'n wyer reeks toestande handhaaf.
Spesifikasie
| Voorkoms | Wit tot naaswit amorfe poeier, gelyofiliseer |
| Spesifieke aktiwiteit | ≥40E/mg vaste stof |
| DNase | Geen bespeur nie |
| RNase | Geen bespeur nie |
| Biolas | ≤50CFU/g vaste stof |
| Nukleïensuurresidu | <5 pg/mg vaste stof |
Eienskappe
| Bron | Tritirachium album |
| EC nommer | 3.4.21.64(Rekombinant van Tritirachium album) |
| Molekulêre gewig | 29 kDa (SDS-BLADSY) |
| Iso-elektriese punt | 7.81 Fig.1 |
| Optimale pH | 7.0-12.0 (Almal verrig hoë aktiwiteit) Fig.2 |
| Optimum temperatuur | 65℃ Fig.3 |
| pH stabiliteit | pH 4,5-12,5 (25℃,16h) Fig.4 |
| Termiese stabiliteit | Onder 50℃ (pH 8.0, 30min) Fig.5 |
| Bergingsstabiliteit | Geberg by 25℃ vir 12 maande Fig.6 |
| Aktiveerders | SDS, ureum |
| Inhibeerders | Diisopropylfluorofosfaat;bensielsulfonielfluoried |
Bergingsvoorwaardes
Berg die gevriesdroogde poeier by -25~-15 ℃ vir 'n lang tyd weg van lig;Na ontbinding, deel in gepaste volume vir korttermynberging by 2-8℃ weg van lig of langtermynberging by -25~-15 ℃ weg van lig.
Voorsorgmaatreëls
Dra beskermende handskoene en -bril tydens gebruik of weeg, en hou goed geventileer na gebruik.Hierdie produk kan velallergiese reaksies en ernstige oogirritasie veroorsaak.As dit ingeasem word, kan dit allergie- of asmasimptome of dyspnee veroorsaak.Kan respiratoriese irritasie veroorsaak.
Eenheid definisie
Een eenheid van NGS Protease K word gedefinieer as die hoeveelheid ensiem wat benodig word om kaseïen te hidroliseer in 1 μmol L-tirosien onder standaardbepalingstoestande.
Reagense voorbereiding
| Reagens | Vervaardiger | Katalogus |
| Kaseïen tegniesvan beesmelk | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemieseReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Sinopharm ChemieseReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChemieseReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Trichloorasynsuur | Sinopharm ChemieseReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Natrium asetaat | Sinopharm ChemieseReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Asynsuur | Sinopharm ChemieseReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChemieseReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Natriumkarbonaat | Sinopharm ChemieseReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Folien-fenol | Sangon Biotech (Sjanghai)Co., Bpk. | A500467-0100 |
| L-tirosien | Sigma | 93829 |
Reagens I:
Substraat: 1% Kaseïen van beesmelkoplossing: los 1g beesmelkkaseïen op in 50ml 0,1M natriumfosfaatoplossing, pH 8,0, verhit in waterbad by 65-70 °C vir 15 minute, roer en los op, koel af met water, verstel deur natriumhidroksied tot pH 8.0, en verdun in tot 100ml.
Reagens II:
TCA-oplossing: 0,1M trichloorasynsuur, 0,2M natriumasetaat en 0,3M asynsuur (weeg 1,64g trichloorasynsuur + 1,64g natriumasetaat + 1,724mL asynsuur agtereenvolgens, voeg 50mL gedeïoniseerde water by, verstel met HCl03 tot pH03. 100 ml).
Reagens III:
0,4 m natriumkarbonaatoplossing (weeg 4,24 g watervrye natriumkarbonaat en los op in 100 ml water)
Reagens IV:
Folienfenolreagens: verdun 5 keer met gedeïoniseerde water.
Reagens V:
Ensiemverdunningsmiddel: 0,1 M natriumfosfaatoplossing, pH 8,0.
Reagens VI:
L-tirosien-standaardoplossing: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tirosien opgelos met 0,2M HCl.
Prosedure
1. Skakel die UV-Vis-spektrofotometer aan en kies fotometriese meting.
2. Stel die golflengte as 660nm.
3. Skakel die waterbad aan, stel die temperatuur op 37℃, verseker die temperatuur onveranderd vir 3-5min.
4. Voorverhit 0.5mL substraat in 'n 2mL sentrifugebuis by 37℃ waterbad vir 10min.
5. Onttrek 0.5mL verdunde ensiemoplossing in die voorverhitte sentrifugebuis vir 10 minute.Stel ensiemverdunningsmiddel as leë groep.
6. Voeg 1.0 mL TCA-reagens onmiddellik na die reaksie by.Meng goed en inkubeer in waterbad vir 30 minute.
7. Sentrifugeer reaksie oplossing.
8. Voeg die volgende komponente by in die volgorde wat gespesifiseer is.
| Reagens | Volume |
| Supernatant | 0,5 ml |
| 0,4M natriumkarbonaat | 2,5 ml |
| Folien fenol reagens | 0,5 ml |
9. Meng goed voor inkubasie in waterbad by 37℃ vir 30 minute.
10. OD660is as OD bepaal1;blanko kontrolegroep: Ensiemverdunningsmiddel word gebruik om ensiemoplossing te vervang om OD te bepaal660as OD2, ΔOD=OD1-OD2.
11. L-tirosien standaardkromme: 0,5 ml verskillende konsentrasies L-tirosien oplossing, 2,5 ml 0,4 M natriumkarbonaat, 0,5 ml Folien fenol reagens in 5 ml sentrifuge buis, inkubeer in 37 ℃ vir 30 minute, bespeur vir OD660vir verskillende konsentrasies L-tirosien, verkry dan die standaardkromme Y=kX+b,waar Y die L-tirosienkonsentrasie is, X OD is600.
Berekening
2: Totale volume reaksie-oplossing (ml)
0.5: Volume ensiemoplossing (ml)
0.5: Reaksievloeistofvolume gebruik in chromogeniese bepaling (mL)
10: Reaksietyd (min)
Df: Verdunningsveelvoud
C: Ensiemkonsentrasie (mg/ml)
Syfers
Fig.1 DNA-residu
| Voorbeeld | Ave C4 | Nukleïensuur Herstel (pg/mg) | Herstel (%) | Totale nukleïens Suur ( pg/mg) |
| PRK | 24,66 | 2.23 | 83% | 2,687 |
| PRK+STD2 | 18,723 | 126,728 | — | — |
| STD1 | 12,955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19,125 | |||
| STD4 | 23,135 | |||
| STD5 | 26,625 | |||
| RNA-vrye H2O | Onbepaald | — | — | — |
Fig.2 Optimum pH
Fig.3 Optimum temperatuur
Fig.4 pH-stabiliteit
Fig.5 Termiese stabiliteit
Fig.6 Bergingstabiliteit by 25℃
