EndoFree Plasmid Maxi Kit

Bergingstoestande

RNaseA moet by -30 ~ -15℃ gestoor word en by ≤0℃ vervoer word.

Endotoxine Scavenger kan gestoor word by 2 ~ 8 ℃ vir een maand, gestoor word by -30 ~ -15 ℃ vir langtermyn bergingen vervoer teen ≤0℃.

Ander komponente moet by kamertemperatuur (15 ~ 25 ℃) gestoor word en by kamertemperatuur vervoer word.

Komponente

RNaseA:10 mg/ml, gebruik om RNA te verwyder.

Buffer P1:bakteriese suspensiebuffer, voeg RNaseA by Buffer P1 voor die eerste gebruik.

Buffer P2:bakteriële lisisbuffer (wat SDS/NaOH bevat).

Buffer P4:neutraliserende buffer.

Endotoksien aasmiddel:verwyder effektief endotoksien uit die ru-plasmiedekstrak.

Buffer PW:wasbuffer, voeg die vasgestelde volume etanol by voor die eerste gebruik.

Buffer TB:elueringsbuffer.

FastPure DNA Maxi-kolomme:plasmied DNA adsorpsie kolomme.

Versamelingsbuise 50 ml:filtraatversamelbuise.

Endotoksienvrye versamelbuis:plasmied DNA versameling buise.

Voorbereide materiaal

Absolute etanol, isopropanol, 50 ml ronde bodem sentrifugeerbuise en 50 ml endotoksienvrysentrifugeerbuise.

Aansoeke

Hierdie produk is geskik vir grootskaalse ekstraksie van plasmiede van 150 - 300 ml bakteriese oplossingoornag gekweek.

Eksperiment Proses

1. Neem 150 – 200 ml (nie meer as 300 ml) bakteriese oplossing wat oornag gekweek is en sentrifugeer byongeveer 11 000 rpm (12 000 × g) vir 1 – 2 min.Gooi die supernatant weg en versamel bakterieë.

Δ Wanneer meer as 50 ml bakteriese oplossing versamel word, kan die bakterieë versamel word deur bakteriële oplossing by te voeg, sentrifugering, weggooi van die supernatant en ander stappe in dieselfde 50 ml buis vir

verskeie kere.

2. Voeg 7,5 ml Buffer P1 (kontroleer asseblief of RNaseA by Buffer P1 gevoeg is) by die sentrifugebuis wat bakterieë bevat en meng deeglik deur te vortex of pipet.

Δ Die volledige hersuspensie van bakterieë in hierdie stap is van kritieke belang om te lewer, en daar behoort geen bakteriese klonte te wees na hersuspensie nie.As daar bakteriese klonte is wat nie deeglik gemeng is nie, sal dit die lise beïnvloed, wat 'n lae opbrengs en suiwerheid tot gevolg het.As die OD600 van bakteriese oplossing 0,65 is, word aanbeveel dat 7,5 ml Buffer P1 gebruik word wanneer uit 150 ml bakteriese oplossing onttrek word;wanneer OD600 0.75 is, moet 8 ml Buffer P1 gebruik word en die volumes Buffers P2 en P4 moet dienooreenkomstig verander word.As die volume van die bakteriese oplossing tot 200 ml verhoog word, word dit aanbeveel dat dievolume van buffers P1, P2 en P4 proporsioneel verhoog word.

3. Voeg 7.5 ml Buffer P2 by die bakteriese suspensie vanaf stap 2 en meng liggies op en af ​​vir 6 – 8keer en inkubeer by kamertemperatuur vir 4 – 5 min.

Δ Keer liggies om om deeglik te meng.Vortexing sal die genomiese DNA-fragmentasie veroorsaak, wat lei tot genomiese DNA-fragmente in die onttrekte plasmied.Op hierdie tydstip word die oplossing viskeus en deurskynend, wat wys dat die bakterieë volledig gelys is.Die duur moet nie 5 minute oorskry nie om vernietiging van die plasmiede te voorkom.As die oplossing nie helder is nie, kan daar te veel bakterieë wees wat tot gevolg hetonvolledige lise, dus moet die hoeveelheid bakterieë gepas verminder word.

4. Voeg 7.5 ml Buffer P4 by die bakteriële suspensie vanaf stap 3 en draai dadelik liggies 6 – 8 keer om sodat die oplossing Buffer P2 heeltemal neutraliseer.Op hierdie tydstip moet wit vlokkige neerslag verskyn.Sentrifugeer teen meer as ongeveer 11 000 rpm (12 000 × g) vir 10 – 15 minute, gooi die supernatant versigtig in 'n nuwe 50 ml ronde-bodem sentrifugebuis (selfvoorbereid) en vermyaspireer die drywende wit neerslag.

Δ Voeg Buffer P4 by en keer dadelik om om goed te meng.Laat die buis staan ​​totdat die wit neerslag eweredig deur die oplossing versprei is om die produksie van plaaslike neerslag te voorkom wat neutralisasie kan beïnvloed.As daar geen eenvormige wit flokkulente neerslag voor sentrifugering is nie en die supernatant is nie duidelik na sentrifugering nie, kan die buisgesentrifugeer vir nog 5 min.

5. Voeg 0. 1 keer die volume (10% van die supernatant volume, ongeveer 2.2 ml) Endotoxin Scavenger by die supernatant vanaf stap 4 en keer om om te meng.Plaas die oplossing in 'n ysbad of plaas dit in gebreekte ys (of yskas-vrieskas) vir 5 minute totdat die oplossing verander van troebel na helder en deursigtig (of nog steedseffens troebel), en meng af en toe verskeie kere.

Δ Nadat die Endotoxin Scavenger by die supernatant gevoeg is, sal die supernatant troebel word maar diesupernatant moet duidelik (of effens troebel) word nadat dit in die ysbad afgekoel het.

6. Nadat die supernatant vir 10 – 15 min by kamertemperatuur (>25℃) geplaas is, sal dit troebel word soossy temperatuur styg tot kamertemperatuur.Dan moet die supernatant omgekeer word om te meng.

Δ As kamertemperatuur laer is of jy die ekstraksietyd wil verminder, kan die supernatant vir 5 – 10 min in 'n 37 ~ 42 ℃ waterbad geïnkubeer word en die volgende stap kan na die supernatant uitgevoer wordtroebel word.

7. Sentrifugeer die supernatant teen ongeveer 11 000 rpm (12 000 × g) vir 10 min by kamertemperatuur (temperatuur moet >25℃ wees) om die fase te skei.Die boonste waterfase bevat die DNS terwyl die onderste blou olierige laag endotoksien en ander onsuiwerhede bevat.Dra die oorDNA-bevattende waterfase na 'n nuwe buis engooi die olierige laag weg.

Δ Die temperatuur tydens sentrifugering moet meer as 25℃ wees, aangesien effektiewe faseskeiding dit nie doen nieplaasvind as die temperatuur te laag is.

Δ As die faseskeiding nie effektief is nie, kan die sentrifugering temperatuur aangepas word na 30 ℃ endie tyd van sentrifugering kan tot 15 min verhoog word.

Δ Moenie die blou olierige laag suig nie, want dit bevat endotoksien en ander onsuiwerhede.

Meganisme

Hersuspensie Lysis Neutralisasie

◇ Voeg 7,5 ml buffer P1 by

◇ Voeg 7,5 ml buffer P2 by

◇ Voeg 7,5 ml buffer P4 by

Endotoksien verwydering

◇ Voeg 0. 1 keer die supernatantvolume Endotoxin Scavenger by

Binding en Was

◇ Voeg 0,5 keer die volume isopropanol by

◇ Voeg 10 ml buffer PW by