Proteïenase K (vloeistof)
Kat nommer: HC4502A
Proteïenase K is 'n stabiele serienprotease met breë substraatspesifisiteit.Dit breek baie proteïene af in die inheemse toestand, selfs in die teenwoordigheid van skoonmaakmiddels.Bewyse uit kristal- en molekulêre struktuurstudies dui daarop dat die ensiem aan die subtilisienfamilie behoort met 'n aktiewe plek-katalitiese triade (Asp)39-Syn69- Ser224).Die oorheersende plek van splitsing is die peptiedbinding aangrensend aan die karboksielgroep van alifatiese en aromatiese aminosure met geblokkeerde alfa-aminogroepe.Dit word algemeen gebruik vir sy breëspesifisiteit.
Spesifikasie
| Voorkoms | Kleurlose tot ligbruin vloeistof |
| Aktiwiteit | ≥800 U/ml |
| Proteïen konsentrasie | ≥20 mg/ml |
| DNase | Geen bespeur nie |
| RNase | Geen bespeur nie |
Bergingsvoorwaardes
Berg by 'n temperatuur van 2-8 ℃.
Eienskappe
| EC nommer | 3.4.21.64 (Rekombinant van Tritirachium album) |
| Molekulêre gewig | 29 kDa (SDS-BLADSY) |
| Iso-elektriese punt | 7,81 |
| Optimale pH | 7.0-12.0 Fig.1 |
| Optimum temperatuur | 65 ℃ Fig.2 |
| pH stabiliteit | pH 4,5-12,5 (25℃, 16 uur) Fig.3 |
| Termiese stabiliteit | Onder 50℃ (pH 8.0, 30 minute) Fig.4 |
| Aktiveerders | SDS, ureum |
| Inhibeerders | Diisopropylfluorofosfaat;fenielmetielsulfonielfluoried |
Aansoeke
1. Genetiese diagnostiese kit
2. RNA- en DNA-ekstraksiestelle
3. Onttrekking van nie-proteïenkomponente uit weefsels, afbreek van proteïen onsuiwerhede, soos DNA-entstowwe en voorbereiding van heparien
4. Voorbereiding van chromosoom DNA deur gepulseerde elektroforese
5. Westerse klad
6. Ensiematiese geglikosileerde albumienreagense in vitro diagnose
Voorsorgmaatreëls
Dra beskermende handskoene en -bril tydens gebruik of weeg, en hou goed geventileer na gebruik.Hierdie produk kan velallergiese reaksies en ernstige oogirritasie veroorsaak.As dit ingeasem word, kan dit allergie- of asmasimptome of dyspnee veroorsaak.Kan respiratoriese irritasie veroorsaak.
Toets
Eenheid definisie
Een eenheid (U) word gedefinieer as die hoeveelheid ensiem wat benodig word om kaseïen te hidroliseer om 1 μmol tirosien per minuut te produseer onder die volgende toestande.
Reagense voorbereiding
Reagens I: 1 g melkkaseïen is opgelos in 50 ml 0.1M natriumfosfaatoplossing (pH 8.0), vir 15 minute in 65-70 ℃ water geïnkubeer, geroer en opgelos, deur water afgekoel, met natriumhidroksied aangepas tot pH 8.0, en vasgemaak volume 100ml.
Reagens II: TCA-oplossing: 0,1 M trichloorasynsuur, 0,2 M natriumasetaat, 0,3 M asynsuur.
Reagens III: 0,4M Na2CO3oplossing.
Reagens IV: Forint-reagens verdun met suiwer water vir 5 keer.
Reagens V: Ensiemverdunningsmiddel: 0.1M natriumfosfaatoplossing (pH 8.0).
Reagens VI: Tirosienoplossing: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirosien opgelos met 0,2M HCl.
Prosedure
1. 0.5ml reagens I word vooraf verhit tot 37℃, voeg 0.5ml ensiemoplossing by, meng goed en inkubeer by 37℃ vir 10min.
2. Voeg 1 ml reagens II by om die reaksie te stop, meng goed en gaan voort met inkubasie vir 30 minute.
3. Sentrifugeer reaksie oplossing.
4. Neem 0.5ml supernatant, voeg 2.5ml reagens III, 0.5ml reagens IV by, meng goed en inkubeer by 37℃ vir 30min.
5. OD660is as OD bepaal1;blanko kontrolegroep: 0.5ml reagens V word gebruik om ensiemoplossing te vervang om OD te bepaal660as OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. L-tirosien standaardkurwe: 0,5 ml verskillende konsentrasies L-tirosien oplossing, 2,5 ml reagens III, 0,5 ml reagens IV in 5 ml sentrifugebuis, inkubeer in 37 ℃ vir 30 minute, bespeur vir OD660vir verskillende konsentrasies L-tirosien, verkry dan die standaardkromme Y=kX+b, waar Y die L-tirosienkonsentrasie is, X OD is600.
Berekening
2: Totale volume reaksie-oplossing (ml)
0.5: Volume ensiemoplossing (ml)
0.5: Reaksievloeistofvolume gebruik in chromogeniese bepaling (mL)
10: Reaksietyd (min)
Df: Verdunningsveelvoud
C: Ensiemkonsentrasie (mg/ml)
Verwysings
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biofis.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,EUR.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2de uitgawe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor(1989).
Syfers
Fig. 1 Optimum pH
100mM bufferoplossing: pH6.0-8.0, Na-fosfaat;pH8.0- 9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, glisien-NaOH. Ensiemkonsentrasie: 1mg/ml
Fig. 2 Optimum temperatuur
Reaksie in 20mM K-fosfaatbuffer pH 8.0.Ensiemkonsentrasie: 1mg/ml
Fig. 3 pH Stabiliteit
25℃,16 h-behandeling met 50mM bufferoplossing: pH 4.5-5.5, asetaat;pH 6,0-8,0, Na-fosfaat;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, glisien-NaOH.Ensiemkonsentrasie: 1mg/ml
Fig. 4 Termies stabiliteit
30 min-behandeling met 50mM Tris-HCl buffer, pH 8.0.Ensiemkonsentrasie: 1mg/ml
Fig. 5 Berging stability at 25℃
