DNA-ekstraksie-ministel
Hierdie stel gebruik geoptimaliseerde bufferstelsel en silikagelkolomsuiweringstegnologie, wat 70 bp – 20 kb DNA-fragmente van verskillende konsentrasies TAE- of TBE-agarosegel kan herwin.DNS-adsorpsiekolom kan DNS spesiaal adsorpeer onder hoë-sout toestand.Daarbenewens kan die kit DNS-fragmente direk suiwer van PCR-produkte, ensiematiese reaksiestelsels of ru-DNS-produkte wat deur ander metodes verkry word, en onsuiwerhede soos proteïene, ander organiese verbindings, anorganiese souione en oligonukleotied-inleiders verwyder.Dit kan verseker dat die suiwering binne 10-15min voltooi kan word.Die gesuiwerde DNA kan direk gebruik word vir afbinding, transformasie, ensiemvertering, in vitro transkripsie, PCR, volgordebepaling, mikro-inspuiting, ens.
Bergingstoestande
Berg by -15 ~ -25 ℃ en vervoer by kamertemperatuur.
Komponente
Komponente | (100 rxns) |
Buffer BBP | 80 ml |
Buffer GW | 2 × 20 ml |
Elueringsbuffer | 20 ml |
FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
Buffer BBP:DNA binding buffer.
Buffer GW:Wasbuffer;voeg absolute etanol by die aangeduide volume op die bottel voor gebruik.
Elueringsbuffer:Eluering.
FastPure DNA Mini Columns-G:DNA-adsorpsiekolomme.
Versamelingsbuise 2 ml:Versamelingsbuise vir filtraat.
Voorbereide materiaal
1,5 ml gesteriliseerde buise, absolute etanol en isopropanol (wanneer DNA-fragment ≤100 bp, voeg 1 volume by
isopropanol tot 1 volume gel), waterbad.
Eksperiment Proses
Voeg 80 ml etanol by om Buffer GW te verdun soos aangedui op etiket voor gebruik, berg by kamertemperatuur.
Meganisme
1. PCR reaksie oplossing
Gel-ekstraksieskema: Voeg gelyke volume Buffer BBP PCR-reaksieoplossing-herwinningskema by:Voeg 5 keer die volume Buffer by
2. BBP Bereken die volume gel (100 μl is gelyk aan 100 mg)
Los gel op
3. Voorverhit by 50 ~ 55℃
4. Bind Was
Voeg 300 μL buffer BBP by*
Voeg 700 μL buffer GW by
Voeg 700 μL buffer GW by
5. Elueer
Voeg 20 – 30μL elueringsbuffer of gedeïoniseerde water by
Notas* PCR reaksie vloeistof herstel sonder hierdie stap
Gel ekstraksie program
1. Na DNS-elektroforese vir fraksionering van DNS-fragmente, sny die enkele streep DNS-fragment uit die agarosegel onder UV-lig.Dit word aanbeveel om absorberende papier te gebruik om oënskynlike vog van gel te absorbeer en die grootte van die gel-skyfie te verminder deur ekstra agarose as moontlik te verwyder.Weeg die jelskyf (sonder mikrosentrifugebuis) om sy volume te bereken: Die volume van 100 mg jelsny is ongeveer 100 μL, met die veronderstelling dat die digtheid 1g/ml is.
2. Voeg gelyke volume Buffer BBP by, inkubeer by 50~55℃ vir 7-10 min (volgens die gelgrootte, pas inkubasietyd aan totdat die gel heeltemal opgelos is).Keer die buis 2 keer om tydens die inkubasie.
Δ Byvoeging van 1-3 volumes Buffer BBP sal nie DNS-herwinningsdoeltreffendheid beïnvloed nie.Indien die DNA-fragment wat herwin moet word <100 bp, moet 3 volumes Buffer BBP bygevoeg word;wanneer die jelskyf heeltemal opgelos het, voeg 1 volume isopropanol by en meng deeglik, gaan dan voort na die volgende stap.
3. Sentrifugeer kortliks om die monster na die onderkant van die buis te bring, plaas die FastPure DNA Mini Columns-G in die versamelbuisies 2 ml, dra die oplossing versigtig van maksimum 700 μL een keer per
tyd na die filtrasiekolomme, sentrifugeer teen 12 000 rpm (13 800 X g) vir 30-60 sek.
4. Gooi die filtraat weg en voeg 300 μL Buffer BBP by die kolom, inkubeer by kamertemperatuur vir 1 min, sentrifugeer by 12 000 rpm (13 800 X g) vir 30-60 sek.
5. Gooi die filtraat weg en voeg 700 μL Buffer GW (kyk of absolute etanol vooraf bygevoeg is!) by die kolom, sentrifugeer teen 12 000 rpm (13 800 X g) vir 30-60 sek.
Δ Voeg asseblief Buffer GW om die adsorpsiekolomwand by, of voeg Buffer GW agterblad by en meng dit onderstebo vir 2 – 3 keer om te help om die sout wat aan die buiswand kleef, heeltemal te spoel.
6. Herhaal stap 5.
Δ Spoel met Buffer GW twee keer kan verseker dat die sout heeltemal verwyder word en die impak op daaropvolgende eksperimente uitskakel.
7. Gooi die filtraat weg en sentrifugeer die leë kolom teen 12 000 rpm (13 800 X g) vir 2 min.
8. Plaas die kolom in 'n skoon 1,5 ml mikrosentrifugeerbuis, voeg 20 - 30 μL elueringsbuffer by die middel van die kolommembraan, inkubeer vir 2 min, en sentrifugeer dan teen 12 000 rpm (13 800 X g) vir 1 min.Gooi die kolom weg, stoor die verkryde DNA by -20 .
Δ Die oordrag van die supernatant van stap 8 na die kolom om weer te elueer en die voorverhitting van die elueringsbuffer tot 55 (wanneer DNA-fragment >3 kb) dalk nuttig is om die herwinningsdoeltreffendheid te verhoog.
PCR produkte herstel program
Hierdie protokol is van toepassing om DNS-fragmente van PCR-produkte, ensiematiese reaksiestelsel en ander DNS-ruprodukte (insluitend genetiese DNS) te suiwer.Hierdie oplossing kan verskeie nukleotiede, primers, primer dimers, soutmolekules, ensieme en ander onsuiwerhede doeltreffend verwyder.
1. Sentrifugeer kortliks PCR-produkte, ensiematiese reaksie-oplossing en ander DNA-ruprodukte.Skat hul volume met pipet en dra oor na 'n gesteriliseerde 1,5 ml of 2 ml buis.Voeg ddH2O by tot die volume tot 100 μL;terwyl vir genomiese DNA met hoë konsentrasie, verdunning tot 300 μL met ddH2O sal help om hersteldoeltreffendheid te verbeter.
2. Voeg 5 volumes Buffer BBP by, meng deeglik deur om te keer of te vortex.Indien DNS-fragment van belang >100 bp, moet addisionele 1.5 volumes (monsters + Buffer BBP) etanol bygevoeg word.
3. Plaas die kolom terug in die versamelbuis, dra die mengsel oor na die kolom, sentrifugeer teen 12 000 rpm (13 800 × g) vir 30 – 60 sek.As die volume van die gemengde oplossing >700 µL is, plaas die adsorpsiekolom terug in die versamelbuis, dra die oorblywende oplossing oor na die adsorpsiekolom, en sentrifugeer teen 12 000 rpm (13 800 × g) vir 30 – 60 sek.
4. Die volgende uitvoering verwys na stap 5 – 8 van 08- 1/Jel ekstraksieprogram.
Aansoeke
Verskeie konsentrasies TAE of TBE agarose gel;PCR-produkte, ensiematiese reaksiestelsels of ander ru-DNS-produkte verkry deur verskeie metodes.Herwin fragmente het gewissel van70 bp -20 kb.
Notas
Slegs vir navorsingsgebruik.Nie vir gebruik in diagnostiese prosedures nie.
1. Voeg 80 ml etanol by om Buffer GW te verdun soos aangedui op etiket voor gebruik, stoor by kamertemperatuur.
2. As die Buffer BBP maklik is om te presipiteer tydens lae-temperatuur berging, kan dit by kamertemperatuur geplaas word vir 'n tydperk voor gebruik.Indien nodig, kan dit in 'n 37℃ waterbad voorverhit word totdat die neerslag heeltemal opgelos is, en dan kan dit na vermenging gebruik word.
3. Stel die waterbadtemperatuur vooraf op 50 ~55℃.
4. In 08-1/Gel-ekstraksieprogram stap 1, sal die minimalisering van die grootte van gelskyf die oplostyd aansienlik verminder en die hersteldoeltreffendheid verhoog (gelineariseerde DNA is maklik om te hidroliseer wanneer dit voortdurend by hoë temperatuur blootgestel word).Moenie DNA-gel vir lang tyd aan UV blootstel nie, aangesien ultraviolet lig DNA-skade kan veroorsaak.
5. Los die jel in 08- 1/Gel-ekstraksieprogram stap 2 heeltemal op, anders sal die DNS-herwinningsdoeltreffendheid ernstig beïnvloed word.
6. Voorverhit elueringsbuffer of ddH2O tot 55 ℃, wat nuttig is om DNS-elutiedoeltreffendheid te verbeter.Dit word aanbeveel om DNA te stoor in eluent van 2.5 mM Tris-HCl, pH 7.0 – 8.5.