Urasiel DNA Glikosilase
Uracil-DNA Glycosylase (UNG of UDG) is 'n rekombinante kloon van E.coli met 'n molekulêre gewig van 25 kDa.Dit kataliseer die vrystelling van vry uracil vanaf uracil-bevattende enkel- en dubbelstring DNA, en is onaktief teen RNA, en kan gebruik word om kontaminasie van PCR amplifikasie produkte te voorkom.Die beginsel van werking is gebaseer op die feit dat indien dUTP in die PCR-reaksie vir dTTP vervang word en 'n PCR-amplifikasieproduk wat dU-basisse bevat word gevorm, die ensiem selektief die glikosidiese binding van U-basisse in enkel- en dubbelstrings kan breek DNA en degradeer die PCR-amplifikasieproduk.
Aanbevole toepassing
Kontaminasie Voorkoming Amplifikasie
Berging Toestand
-20°C vir langtermynberging, moet goed gemeng word voor gebruik, vermy gereelde vries-ontdooiing.
Berging buffer
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, stabiliseerder, 50% gliserol.
Eenheid Definisie
Die hoeveelheid ensiem wat benodig word om 1µg enkelstring-DNS wat dU-basisse bevat in 1 uur by 37°C af te breek, is 1 eenheid.
Kwaliteitsbeheer
1.SDS-PAGE elektroforetiese suiwerheid groter as 98%
2.Amplifikasie sensitiwiteit, bondel-tot-batch beheer, stabiliteit
3.Nadat 1U UNG vir 2 minute by 50 ℃ behandel is, moet die sjabloon wat U onder 103 kopieë bevat heeltemal afgebreek word en geen amplifikasieproduk kan vervaardig word nie
4.Geen eksogene nuklease-aktiwiteit nie
Instruksies
| Komponente | Volume (μL) | Finale konsentrasie |
| 10 × PCR-buffer (dNTP-vry, Mg²+vry) | 5 | 1× |
| dUTP's (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (vervang dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Primer Mengsela | 2 | 1× |
| Sjabloon | - | ＜1μg/reaksie |
| ddH₂O | Tot 50 | - |
Let wel: a: Indien dit vir qPCR/qRT-PCR gebruik word, moet die fluoresserende sonde by die reaksiestelsel gevoeg word.Gewoonlik kan 'n finale onderlaagkonsentrasie van 0,2 μM goeie resultate gee;wanneer die reaksieprestasie swak is, kan die onderlaagkonsentrasie in die reeks van 0.2-1 μM aangepas word.Gewoonlik word die sondekonsentrasie geoptimaliseer in die reeks van 0.1-0.3 μM.Konsentrasiegradiënteksperimente kan uitgevoer word om die beste kombinasie van onderlaag en sonde te vind.
Notas
1.UNG ensiem kan gebruik word om die gekontamineerde dUTP amplifikasie produkte uit die reaksie sisteem te verwyder voor die PCR amplifikasie reaksie, dan om vals positiewe resultate as gevolg van produk kontaminasie te vermy.
2.Die optimale temperatuur vir UNG-ensiem om in die anti-kontaminasie PCR-reaksie te gebruik is oor die algemeen 50 ℃ vir 2 minute;die inaktiveringstoestand is 95 ℃ vir 5 minute.
3.Vermy gereelde vries-ontdooiing, en moenie aan groot temperatuurskommelings blootstel nie.
4.Verskillende gene wat geamplifiseer moet word het verskillende benuttingsdoeltreffendheid van dUTP en sensitiwiteit vir UNG-ensiem, dus, indien die gebruik van UNG-stelsel lei tot 'n afname in opsporingsensitiwiteit, moet die reaksiestelsel aangepas en geoptimaliseer word, indien u tegniese ondersteuning benodig, kontak asseblief ons maatskappy.
