Plant direkte PCR Kit
Kat nommer: HCR2020A
Plant Direct PCR Kit is geskik vir direkte amplifikasie van plantblare, sade, ens., en kan gebruik word vir hoë-deurset sifting van plantmonsters wat nie polisakkariede en polifenole bevat nie.Die direkte amplifikasie DNA-polimerase gebaseer op die gerigte evolusie het superieure verdraagsaamheid teenoor PCR-inhibeerders in plante.Intussen handhaaf dit die hoë amplifikasieprestasie, wat geskik is vir die amplifikasie van DNA-fragmente binne 5 kb.Die unieke Lysis-buffer A in die stel kan gebruik word om vars of bevrore plantweefsels te liseer.Dit is maklik om te bedryf en die lysaat kan as 'n sjabloon vir amplifikasie sonder suiwering gebruik word.Die stelsel bevat beskermende middels wat dit moontlik maak om rumonsters doeltreffend te versterk na herhaalde bevriesing en ontdooiing.2 × Plant Direct Master Mix hoef slegs primers en sjablone by te voeg om amplifikasiereaksie uit te voer, en sodoende pipeteringsoperasies te verminder en opsporing deurset en reproduceerbaarheid van resultate te verbeter.
Komponente
| Komponente | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Plant Direkte Meestermengsel | 1,25 ml | 4×1,25 ml |
| Plant Direkte Lysis Buffer A | 5 ml | 20 ml |
| Plant Direkte Lysis Buffer B* | 5 ml | 20 ml |
*Plant Direkte Lysis Buffer B is 'n opsionele reagens wat gebruik word om Plant Direkte Lysis Buffer A te neutraliseer om die bergingstyd van monsters te verleng.Dit kan gebruik word volgens die werklike situasie.
Bergingsvoorwaardes
2 × Plant Direct Master Mix, stoor by -30 ~ -15℃ en vermy herhaalde vriesing en ontdooiing;Plant direkte lysisbuffer, stoor by -30 ~ -15 ℃ of 2 ~ 8 ℃.
Eksperiment Proses
Voorbeeldverwerking–Plant Blaar
Direkte metode:Dit word aanbeveel om jong blare te gebruik.Gebruik 'n gatpons met 'n vaste deursnee van 0.5 – 3 mm om 'n klein en eenvormige monstera te verkry, en voeg dan die monster direk by die PKR-stelsel (50 μl-stelsel word aanbeveel).Let wel, maak seker dat die monster in die PCR-oplossing is en nie teen die buiswand nie.As direkte PCR gebruik word om lang fragmente en komplekse monsters te versterk, kan die gebruik van 'n monster met 'n kleiner deursnee (0.5 – 1 mm) as 'n sjabloon help om beter resultate te verkry.
Maal lysis metode:Dit word aanbeveel om jong blare te gebruik.Neem 'n klein stukkie blaar (ongeveer 1 – 3 mm in deursnee), plaas dit in 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, en maal dit soveel as moontlik (hierdie stap kan gedoen word deur die blaar met 'n 100 μl pipetpunt uit te druk om die monster te mash).Indien groter volumes blaarweefsel gebruik word (moenie 7 mm oorskry nie), verhoog die volume verdunningsbuffer tot 50 μl.Nadat die blare gemaal is, moet die oplossing groen lyk.Na 'n kort sentrifugering, voeg 1 μl van die supernatant by die PKR-stelsel as 'n reaksiesjabloonc.
Termiese lysis metode:Dit word aanbeveel om jong blare te gebruik.Neem 'n klein stukkie blaar (ongeveer 1 – 3 mm in deursnee), plaas dit in 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, en verhit dit by 95°C vir 5 – 10 min.Die lysistyd kan gepas verleng word vir blare wat moeilik is om te liseer (nie meer as 20 min).Indien groter volumes blaarweefsel gebruik word (moenie 7 mm oorskry nie), verhoog die volume verdunningsbuffer tot 50 μl.Na verhitting, sentrifugeer kortliks en voeg 1 μl supernatant by die PKR-stelsel as 'n reaksiesjabloonb.
Voorbeeldverwerking– Plant Saad
Maal lysis metode:Gebruik 'n skalpel om sade met 'n deursnee van 5 mm te sny, voeg dit by 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A, en maal die monster met 'n pipetpunt of ander gereedskap.Vortex kort en laat staan by kamertemperatuur vir 3 – 5 min.Maak seker dat die saadmonster in die verdunningsbuffer ondergedompel is.Na 'n kort sentrifugering, voeg 1 μl van die supernatant by die PCR-stelsel as 'n reaksiesjabloon.
Termiese lysis metode:Gebruik 'n skalpel om sade met 'n deursnee van 5 mm te sny, voeg dit by 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A, en verhit by 95°C vir 5 – 10 min.Die lysistyd kan gepas verleng word vir blare wat moeilik is om te liseer (nie meer as 30 min).Na verhitting, sentrifugeer kortliks en voeg 1 μl supernatant by die PCR-stelsel as 'n reaksiesjabloonb.
a.Skêr of ander gereedskap kan ook gebruik word om monsters van geskikte grootte te sny;indien die pons of skêr hergebruik word, moet dit skoongemaak word met 2% natriumhipochloriet oplossing voor elke gebruik om kruiskontaminasie tussen monsters te voorkom.
b.Maak seker dat die Plant Direkte Lysis Buffer volledig gesmelt is voor gebruik.As die buffer viskeus is of neerslae het, kan dit by 37℃ verhit word om dit heeltemal te smelt voor gebruik.
c.Die volume sjabloon in die reaksiestelsel kan toepaslik aangepas word volgens die verskil in die volume plantmateriaal en verdunningsmiddel wat bygevoeg word.
Plant Direkte Lysis Buffer
Die Plant Direkte Lysis Buffer A wat in hierdie produk vervat is, is streng geoptimaliseer om die genoom van die meeste plantweefsels vry te stel en is geskik vir korttermynberging van ru plante by 4℃.Indien die monster vir 'n langer tydperk gestoor moet word (bv. 1 – 2 maande), word dit aanbeveel om die supernatant na 'n nuwe EP-buis oor te plaas en dit by -20℃ te stoor.Om die monsters meer stabiel te stoor, voeg 'n gelyke volume Plant Direkte Lysis Buffer B by die oorgedra supernatant, meng goed en stoor by -20℃.Die stabiele bergingstyd wissel met plantmonsters en toestande.
Reaksiestelsel
| ddH2O | Tot 20,0 µl | Tot 50,0 µl |
| 2 × Plant Direkte Meestermengsela | 10,0 µl | 25,0 µ |
| Onderlaag 1 (10 µM) | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Onderlaag 2 (10 µM)b | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Plant blaar/rou ekstrak monster(Verwys na Voorbeeldverwerking) | 0,5 – 3 mm blaarskyf/x µl | 0,5 – 3 mm blaarskyf/x µl |
a.Dit bevat Mg2+by 'n finale konsentrasie van 2 mM.
b.Dit word aanbeveel om 'n finale konsentrasie van 0.4μM vir elke onderlaag te gebruik.Oormatige gebruik van primers sal lei tot verhoogde niespesifieke amplifikasie.
c.Die hoeveelheid monster wat gebruik word, kan aangepas word volgens die werklike situasie.Die hoeveelheid wat gebruik word in 'n enkele reaksie van ru-gelyseerde monster kan tussen 2% – 20% van die totale volume van die reaksie aangepas word.Die gebruik van te veel monsters kan amplifikasie mislukking veroorsaak.
Reaksie Program
| Trappe | Temperatuur | Tyd |
| Aanvanklike denaturasie | 98℃ | 5 min |
| Denaturasie | 95℃ | 10 sek |
| Uitgloeiing | 58 ~ 72 ℃ | 15 sek |
| Uitbreiding | 72℃ | 30 sek |
| Finale Uitbreiding | 72℃ | 5 min |
a.Aanvanklike denaturering (98 ℃, 5 min) bevorder lisis van plantweefsel, wat genomiese DNA vrystel wat vir PCR-amplifikasie gebruik kan word.Moenie die tyd verkort of die temperatuur verlaag nie.
b.Dit word aanbeveel om dit gelyk te stel aan die primer Tm-waarde of 2 ~ 4℃ hoër as die Tm-waarde.Die direkte amplifikasie-DNA-polimerase wat in hierdie produk gebruik word, verskil van konvensionele Taq DNA-polimerase, en het spesiale vereistes vir die reaksie-gloeitemperatuur; die gebruik van hoë uitgloeiingstemperatuur kan nie-spesifieke amplifikasie effektief verminder en die amplifikasie-doeltreffendheid verbeter.Vir komplekse sjablone kan die doeltreffende versterking bereik word deur uitgloeitemperatuur aan te pas en verlengingstyd te verleng.
c.As die lengte van die versterkingsproduk ≤1 kb is, word die verlengingstyd op 30 sek/kb gestel;as die lengte van die amplifikasieproduk >1 kb is, word die verlengingstyd op 60 sek/kb gestel.
d.Vir komplekse monsters of monsters met lae amplifikasie-opbrengs, kan die aantal siklusse gepas verhoog word tot 40 -50 siklusse.
Aansoeke
Dit is van toepassing vir direkte amplifikasie van plantweefsels en hoë-deurset sifting van plantmonsters wat nie polisakkariede en polifenole bevat nie.
Notas
Slegs vir navorsingsgebruik.Nie vir gebruik in diagnostiese prosedures nie.
1. Vir ru-plantamplifikasie of direkte amplifikasie, word dit aanbeveel om gesuiwerde genomiese DNA as 'n positiewe kontrole te gebruik voordat die eksperiment begin word om te verseker dat die sisteem, primers en bewerkings korrek is.
2. Die direkte amplifikasie-DNA-polimerase wat in hierdie stel gebruik word, het sterk proefleesaktiwiteit.Indien TA-kloning uitgevoer moet word, word dit aanbeveel om die DNA te suiwer voordat die adenien bygevoeg word.
3. Primer Ontwerp Leiding:
a.Dit word aanbeveel dat die laaste basis aan die 3′-punt van die onderlaag G of C moet wees.
b.Opeenvolgende wanpassings moet vermy word in die laaste 8 basisse aan die 3′ einde van die primer.c.Vermy haarnaaldstrukture aan die 3′-punt van die onderlaag.
d.Verskille in die Tm-waarde van die voor- en omgekeerde onderlaag moet nie meer as 1℃ wees nie en die Tm-waarde moet aangepas word na 60 ~ 72℃ (Primer Premier 5 word aanbeveel om die Tm-waarde te bereken).
e.Ekstra bykomende primer-reekse wat nie by die sjabloon pas nie, moet nie ingesluit word wanneer die primer Tm-waarde bereken word nie.
f.Dit word aanbeveel dat die GC-inhoud van die onderlaag 40% -60% moet wees.
g.Die algehele verspreiding van A, G, C en T in die onderlaag moet so ewe moontlik wees.Vermy die gebruik van streke met 'n hoë GC- of AT-inhoud.
h.Vermy die teenwoordigheid van komplementêre rye van 5 of meer basisse óf binne die primer óf tussen twee primers en vermy die teenwoordigheid van komplementêre rye van 3 of meer basisse aan die 3'-punt van twee primers.
i.Gebruik die NCBI BLAST-funksie om die spesifisiteit van die primer na te gaan om nie-spesifieke amplifikasie te voorkom.
