Vaccinia-virus-beperkende ensiem

Vaccinia-virus-afdop-ensiem is afgelei van 'n rekombinante E. coli-stam wat die gene vir die Vaccinia-afdek-ensiem dra.Hierdie enkele ensiem is saamgestel uit twee subeenhede (D1 en D12) en het drie ensiematiese aktiwiteite (RNA trifosfatase en guanieltransferase deur die D1 subeenheid en guanienmetieltransferase deur die D12 subeenheid).Vaccinia virus Capping Enzyme is effektief om die vorming van kapstruktuur te kataliseer, wat spesifiek die 7-metielguanilaatkapstruktuur (m7Gppp, Cap 0) aan die 5'-punt van RNA kan heg.Cap struktuur (Cap 0) speel 'n belangrike rol in mRNA stabilisering, vervoer en translasie in eukariote.Die afsluiting van RNA deur ensiematiese reaksie is 'n effektiewe en eenvoudige metode wat die stabiliteit en translasie van RNA aansienlik kan verbeter vir in vitro transkripsie, transfeksie en mikro-inspuiting.

Komponente

Vaccinia-virus-beperkende ensiem (10 U/μL)

10×Capping buffer

Bergingstoestande

-25～- 15℃ vir berging （Vermy herhaalde vries-ontdooi-siklusse）

Berging buffer

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0.1mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 50% gliserol.

Eenheid Definisie

Een eenheid Vaccinia virus Capping Enzyme word gedefinieer as die hoeveelheid ensiem wat benodig word om 10pmol GTP binne 1 uur by 37°C in 'n 80nt transkripsie in te sluit.

Kwaliteitsbeheer

Eksonuklease:10U van Vaccinia virus Capping Enzyme met 1μg λ-Hind III verteer DNA by 37 ℃ vir 16 uur lewer geen degradasie soos bepaal deur agarose gel elektroforese.

Endonuklease:10U van Vaccinia virus Capping Enzyme met 1μg λDNA by 37℃ vir 16 uur lewer geen degradasie soos bepaal deur agarose gel elektroforese nie.

Nickase:10U van Vaccinia virus Capping Enzyme met 1 μg pBR322 by 37 ℃ vir 16 uur lewer geen degradasie soos bepaal deur agarose gel elektroforese.

RNase:10U van Vaccinia virus Capping Enzyme met 1.6μg MS2 RNA vir 4 uur by 37℃ lewer geen degradasie soos bepaal deur agarose gel elektroforese nie.

1.coli DNA:10U van Vaccinia virus Capping Enzyme word gekeur vir die teenwoordigheid van E. coli genomiese DNA met behulp van TaqMan qPCR met primers spesifiek vir die E. coli 16S rRNA lokus.Die E. coli genomiese DNA kontaminasie is ≤1 E. coli genoom.

2.Bakteries Endotoksien: LAL-toets, volgens Chinese Pharmacopoeia IV 2020-uitgawe, gellimiettoetsmetode, algemene reël (1143).Bakteriële endotoksieninhoud moet ≤10 EU/mg wees.

Reaksiestelsel en toestande

1. Afdekkingsprotokol (reaksievolume: 20 μL)

Hierdie prosedure is van toepassing op die kapreaksie van 10μg RNA (≥100 nt) en dit kan volgens eksperimentele vereistes opgeskaal word.

I) Kombineer 10μg RNA en Nuklease-vrye H2O in 'n 1.5 ml mikrofugbuis tot 'n finale volume van 15.0 µL.*10×Capping Buffer: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

2) Verhit by 65℃ vir 5 minute gevolg deur ysbad vir 5 minute.

3) Voeg die volgende komponente by in die volgorde wat gespesifiseer is

*10×Capping Buffer: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8.0)

4) Inkubeer by 37°C vir 30 minute, RNA is nou bedek en gereed vir stroomaf toedienings.

2. 5′-terminaal etikettering reaksie (reaksie volume: 20 μL)

Hierdie protokol is ontwerp om RNA wat 'n 5' trifosfaat bevat te merk en dit kan volgens vereistes opgeskaal word.Die doeltreffendheid van etiketinkorporering sal beïnvloed word deur die molêre verhouding van RNA:GTP, sowel as die GTP-inhoud in RNA-monsters.

1) Kombineer toepaslike hoeveelheid RNA en nukleasevrye H2O in 'n 1.5 ml mikrofugbuis tot 'n finale volume van 14.0 µL.

2) Verhit by 65℃ vir 5 minute gevolg deur ysbad vir 5 minute.

3) Voeg die volgende komponente by in die volgorde wat gespesifiseer is.

** GTP MIX verwys na GTP en 'n klein aantal merkers.Vir die konsentrasie van GTP, verwysna Nota 3.

4) Inkubeer by 37°C vir 30 minute, RNA 5′ einde is nou gemerk en gereed vir stroomaf

Aansoeke

1. Afdekking van mRNA voor translasietoetse/in vitro translasie

2. Merk 5' einde van mRNA

Notas oor gebruik

1.Verhitting van die oplossing van RNA voor inkubasie met die Vaccinia Capping Enzyme verwyder sekondêre struktuur aan die 5'kant van die transkripsie.Verleng tyd tot 60 minute vir transkripsies met bekende hoogs gestruktureerde 5'-eindes.

2. RNA wat gebruik word vir afdekreaksies moet voor gebruik gesuiwer word en in nukleasevrye water gesuspendeer word.EDTA moet nie teenwoordig wees nie en die oplossing moet vry van soute wees.

3. Vir die etikettering van die 5'-kant moet die totale GTP-konsentrasie ongeveer 1-3 keer die molêre konsentrasie van mRNA in die reaksie wees.

4. Die volume van die reaksiesisteem kan op- of afskaal volgens die werklike.