PNGase F
Peptied-N-Glikosidase F(PNGase F) is die mees doeltreffende ensiematiese metode om byna alle N-gekoppelde oligosakkariede uit glikoproteïene te verwyder.PNGase F is 'n amidase, wat tussen die binneste mees GlcNAc- en asparagienresidu van hoë mannose-, hibriede- en komplekse oligosakkariede van N-gekoppelde glikoproteïene klief.
Toepassing
Hierdie ensiem is nuttig vir die verwydering van koolhidraatreste uit proteïene.
Voorbereiding en spesifikasie
| Voorkoms | Kleurlose vloeistof |
| Proteïen suiwerheid | ≥95% (van SDS-PAGE) |
| Aktiwiteit | ≥500 000 U/ml |
| Eksoglikosidase | Geen aktiwiteit kon bespeur word nie (ND) |
| Endoglikosidase F1 | ND |
| Endoglikosidase F2 | ND |
| Endoglikosidase F3 | ND |
| Endoglikosidase H | ND |
| Protease | ND |
Eienskappe
| EC nommer | 3.5.1.52(Rekombinant van mikro-organisme) |
| Molekulêre gewig | 35 kDa (SDS-BLADSY) |
| Iso-elektriese punt | 8. 14 |
| Optimale pH | 7,0-8,0 |
| Optimum temperatuur | 65 °C |
| Substraat spesifisiteit | Splitsende glikosidiese bindings tussen GlcNAc en asparagienreste Fig.1 |
| Herkenningswebwerwe | N-gekoppelde glikane tensy dit α1-3 fukose bevat Fig. 2 |
| Aktiveerders | DTT |
| Inhibeerder | SDS |
| Stoor temperatuur | -25 ~-15 ℃ |
| Hitte inaktivering | 'n 20µL reaksiemengsel wat 1µL PNGase F bevat, word geïnaktiveer deur inkubasie by 75 °C vir 10 minute. |
Fig. 1 Substraatspesifisiteit van PNGase F
Fig. 2 Herkenning sit van PNGase F.
Wanneer die interne GlcNAc-residue aan α1-3-fukose gekoppel is, kan PNGase F nie N-gekoppelde oligosakkariede van glikoproteïene afsplit nie.Hierdie verandering is algemeen in plante en sommige insekglikoproteïene.
Componente
|
| Komponente | Konsentrasie |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10×Glikoproteïen-denaturerende buffer | 1000 µl |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Eenheid definisie
Een eenheid(U) word gedefinieer as die hoeveelheid ensiem wat benodig word om >95% van die koolhidraat te verwyder uit 10 µg gedenatureerde RNase B in 1 uur by 37°C in 'n totale reaksievolume van 10 µL.
Reaksietoestande
1. Los 1-20 µg glikoproteïen op met gedeïoniseerde water, voeg 1 µl 10×Glycoprotein Denaturing Buffer en H2O (indien nodig) by om 'n totale reaksievolume van 10 µl te maak.
2.Inkubeer by 100°C vir 10 min, koel dit af op ys.
3.Voeg 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 by en meng.
4.Voeg 1-2 µl PNGase F en H by2O (indien nodig) om 'n 20 µl totale reaksievolume te maak en meng.
5.Inkubeer reaksie by 37°C vir 60 min.
6.Vir SDS-PAGE-analise of HPLC-analise.
