mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2´ -O-metieltransferase is afgelei van 'n rekombinante E. coli-stam wat die geen vir die vaccinia mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase dra.Hierdie ensiem voeg 'n metielgroep by by die 2'-O posisie van die eerste nukleotied langs die kapstruktuur aan die 5'kant van die RNA. Die ensiem gebruik S-adenosielmetionien (SAM) as 'n metielskenker om gekapte RNA (cap) te metileer -0) wat lei tot 'n cap- 1 struktuur.

Die Cap1-struktuur kan die translasiedoeltreffendheid verhoog, wat die uitdrukking van mRNA in transfeksie- en mikro-inspuiting-eksperimente verbeter. Hierdie ensiem benodig spesifiek RNA met 'n m7GpppN-dop as substraat.Dit kan nie RNA met pN, ppN, pppN of GpppN aan die 5'-kant gebruik nie.Gekapte RNA kan voorberei word deur in vitro transkripsie deur gebruik te maak van cap analoog of deur ensiematiese afdekking met behulp van die Vaccinia Capping Enzyme.

Komponente

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)

10×Capping-reaksiebuffer

Berging

-25 ～- 15 ℃ vir berging （ Vermy herhaalde vries-ontdooi-siklusse）

Berging buffer

20 mM Tris-HCl (pH 8.0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X-100, 50% gliserol.

Eenheid definisie

Een eenheid word gedefinieer as die hoeveelheid ensiem wat benodig word om 10 pmol van 80 nt-beperkte RNA-transkripsie in 1 uur by 37°C te metileer.

Gehaltebeheertoetse

Eksonuklease:50U van mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase met 1μg λ-Hind III verteer DNA by 37 ℃ vir 16 uur lewer geen degradasie soos bepaal deur agarose gel elektroforese.

Endonuklease: 50 U van mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase met 1 μg λDNA by 37℃ vir 16 uur lewer geen degradasie soos bepaal deur agarosegelelektroforese nie.

Nickase: 50U mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase met 1μg pBR322 by 37 ℃ vir 16 uur lewer geen degradasie soos bepaal deur agarosegelelektroforese nie.

RNase: 50U van mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase met 1.6μg MS2 RNA vir 4 uur by 37℃ lewer geen degradasie soos bepaal deur agarosegelelektroforese nie.

E. coli DNA: 50U van mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase word gekeur vir die teenwoordigheid vanE. coli genomiese DNA met behulp van TaqMan qPCR met primers spesifiek vir dieE. coli 16S rRNA lokus.DieE. coli genomiese DNA kontaminasie is =1E. coli genoom.

Bakteries Endotoksien: LAL-toets, volgens Chinese Pharmacopoeia IV 2020-uitgawe, gellimiettoetsmetode, algemene reël (1143).Bakteriële endotoksieninhoud moet =10 EU/mg wees.

Reaksiestelsel en toestande

1. Kombineer 'n gepaste hoeveelheid Capped RNA en RNase-vrye H2O in 'n 1.5 mL mikrofugbuis tot 'n finale volume van 16.0 µL.

2. Verhit by 65℃ vir 5 minute gevolg deur 'n ysbad vir 5 minute.

3. Voeg die volgende komponente by in die volgorde wat gespesifiseer is (vir metilering van Capped RNA

minder as 10

*10× Capping Reaction Buffer: 500 mM Tris-HCl (pH 8.0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. Inkubeer by 37℃ vir 1 uur (2 uur se inkubasie word aanbeveel vir die teikenfragment minder as 200 nt).

Aansoeke

Om mRNA uitdrukking tydens mikro-inspuiting en transfeksie eksperimente te verbeter.

Notas oor gebruik

1. Voor reaksie moet RNA gesuiwer word en in nukleasevrye water opgelos word, al die oplossings moet geen EDTA en ione bevat nie.

2. Dit word aanbeveel om die monster RNA te verhit by 65℃ vir 5 minute voor die reaksie om die sekondêre struktuur aan die 5'kant van die transkripsie te verwyder.Dit kan verleng word tot 10 min vir komplekse 5 '-terminale struktuur.