M-MLV omgekeerde transkripsie
RevScript Omgekeerde transkriptase word verkry deur genetiese ingenieurstegnologie.Dit het hoër cDNA-sintesevermoë, termiese stabiliteit en reaksietemperatuurlimiet (tot 60°C).Die gesintetiseerde cDNA-produk is tot 10 kb.Dit verhoog die affiniteit van die sjablone en is geskik vir omgekeerde transkripsie van RNA-sjablone met komplekse sekondêre struktuur of lae kopie-gene.
Komponente
| Komponent | HC2003B-01 (10 000 U) | HC2003B-02 (5*10 000 U) | HC2003B-03 (200 000 U) |
| RevScript omgekeerde transkripsie (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 ml |
| 5 × RevScript-buffer | 250 μL | 1,25 ml | 5 ml |
Berging Toestand
Hierdie produk moet vir 2 jaar by -25°C~-15°C gestoor word.
Eenheid Definisie
Een eenheid inkorporeer 1 nmol dTTP in suur-onoplosbare materiaal in 10 minute by 37°C deur Oligo(dT) as onderlaag te gebruik.
Reaksie-opstelling
1.Denaturering van RNA-sjabloon (Hierdie stap is opsioneel, denaturering van RNA-sjabloon help om die sekondêre strukture oop te maak, wat die opbrengs van die eerste string cDNA sal verbeter.)
| Komponente | Volume (μL) |
| RNase vry ddH2O | Tot 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) of Random Primer (50 μmol/L) Of geenspesifieke primers (2 μmol/L) | 1 |
| of 1 | |
| of 1 | |
| RNA-sjabloon | Xa |
Notas:
1) a: Totale RNA: 1-5 ug of mRNA: 1-500 ng
2) Inkubeer by 65°C vir 5 minute, en dra dan dadelik oor op ys om vir 2 minute af te koel.Kort sentrifugering om reaksievloeistof te versamel, voeg die omgekeerde transkripsie-reaksie-oplossing by soos in die volgende tabel getoon.Pipetteer liggies om te meng.
1. Voorbereiding van die reaksiemengsel (20 μL volume)
| Komponente | Volume (μL) |
| Mengsel van vorige stap | 13 |
| 5×buffer | 4 |
| dNTP-mengsel (10nmol/L) | 1 |
| Omgekeerde transkripsie (200 U/μL) | 1 |
| RNase inhibeerder (40 U/μL) | 1 |
1.Voer die reaksie uit onder die volgende toestande:
| Temperatuur (°C) | Tyd |
| 25 °Ca | 5 min |
| 42 °Cb | 15-30 minute |
| 85 °Cc | 5 min |
Notas:
1) a.Inkubasie by 25°C vir 5 minute is slegs nodig vir die gebruik van die ewekansige heksamere.Slaan asseblief hierdie stap oor wanneer jy Oligo (dT) gebruik18of Gene Specific Primer.
2) b.Die aanbevole omgekeerde transkripsietemperatuur is 42°C. Vir sjablone met ingewikkelde sekondêre strukture of hoë GC-inhoud, word dit aanbeveel om die reaksietemperatuur tot 50-55°C te verhoog.
3) c.Verhit by 85°C vir 5 minute om omgekeerde transkripsie te deaktiveer.
4) Die produk kan direk in PCR- of qPCR-reaksies gebruik word, of by -20°C gestoor word vir korttermynberging.Dit word aanbeveel om die produkte in lyn te bring en by -80°C te stoor vir langtermynberging.Vermy gereelde vries-ontdooiing.
5) Die produk is geskik vir een-stap RT-qPCR, dit word aanbeveel om 10-20 U omgekeerde transkripsie by te voeg vir elke 25μL reaksie sisteem, of geleidelik verhoog die hoeveelheid omgekeerde transkripsie volgens die werklike situasie.
Notas
1.Hou asseblief die eksperimentele area skoon;Skoon handskoene en maskers moet tydens operasie gedra word.Al die verbruiksgoedere wat in die eksperiment gebruik word, moet RNase vry wees om RNase kontaminasie te voorkom.
2.Alle prosedures moet op ys uitgevoer word om RNA-afbraak te voorkom.
3. Hoë kwaliteit RNA monsters word aanbeveel om hoë doeltreffendheid van omgekeerde transkripsie te verseker.
4. Hierdie produk is slegs vir navorsingsgebruik.
5. Werk asseblief met laboratoriumjasse en weggooibare handskoene, vir jou veiligheid.
