Dubbelstring-RNA (dsRNA) ELISA-KIT

Hierdie stel is 'n Ensiem-gekoppelde Immunosorbent Assay (ELISA) koppeling met biotien-Streptavidien sisteem, vir kwantitatiewe meting van dsRNA met lengte bo 60 basispare (bp), ongeag die volgorde.Die plaat is vooraf bedek met anti-dsRNA-teenliggaampies.dsRNA teenwoordig in die monster word bygevoeg en bind aan teenliggaampies wat op die putte bedek is.En dan word gebiotinileerde anti-dsRNA-teenliggaampies bygevoeg en bind dit aan dsRNA in die monster.Na was word HRP-Streptavidien bygevoeg en bind aan die gebiotinileerde anti-dsRNA-teenliggaam.Na inkubasie word ongebonde HRP-Streptavidien weggespoel.Dan word TMB-substraatoplossing bygevoeg en deur HRP gekataliseer om 'n blou kleurproduk te produseer wat in geel verander het nadat suurstopoplossing bygevoeg is.Die digtheid van geel is eweredig aan die teiken hoeveelheid dsRNA wat in plaat vasgevang is.Die absorpsie word gemeet by 450 nm.

Toepassing

Hierdie stel is vir kwantitatiewe meting van oorblywende dsRNA.

Kit komponente

Berging en stabiliteit

1. Vir ongebruikte stel: Die hele stel kan by 2 ~ 8 ℃ in rakleeftyd gestoor word.Sterk lig moet vermy word vir bergingsstabiliteit.

2. Vir gebruikte kit: Sodra die mikroplaat oopgemaak is, bedek asseblief ongebruikte putte met plaatverseëlaar en keer terug na die foeliesakkie wat die droogmiddelpak bevat, rits-seël die foeliesak en keer terug na 2~8℃ so gou as moontlik na gebruik.Ander reagense moet so gou as moontlik na gebruik na 2~8℃ teruggeplaas word.

Materiaal benodig maar nie verskaf nie

1. Mikroplaatleser met 450±10nm filter (beter as dit kan opspoor by 450 en 650 nm golflengte).

2. Mikroplaatskudder.

3. RNase-vrye punte en sentrifugeerbuise.

Operasie vloeidiagram

Voor jy begin

1. Bring alle stel komponente en monsters na kamertemperatuur (18-25 ℃) voor gebruik.As die kit nie in een keer opgebruik sal word nie, haal asseblief net stroke en reagense uit vir die huidige eksperiment, en laat die oorblywende stroke en reagense in die vereiste toestand.

2. Wasbuffer: verdun 40mL 20× gekonsentreerde wasbuffer met 760mL gedeïoniseerde of gedistilleerde water om 800mL 1× wasbuffer voor te berei.

3. Standaard: spin of sentrifugeer die voorraadoplossing kort voor gebruik.Die konsentrasie van vier standaarde wat verskaf word, is 5ng/μL.Vir UTP- en pUTP-dsRNA-standaarde, verdun asseblief die voorraadoplossing tot 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL met STE-buffer om die standaardkurwe te teken.Vir N1-Me-pUTP dsRNA-standaarde, verdun asseblief die voorraadoplossing tot 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL met STE-buffer om die standaardkurwe te teken.Vir 5-OMe-UTP dsRNA-standaard, verdun asseblief die voorraadoplossing tot 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL met STE-buffer om die standaardkurwe te teken.Ons beveel aan dat standaarde verdun kan word soos die volgende grafieke:

4. Gebiotinileerde opsporings-teenliggaampies en HRP-streptavidien-werkoplossing: spin of sentrifugeer die voorraadoplossing kort voor gebruik.Verdun hulle tot die werkende konsentrasie met verdunningsbuffer.

5. TMB-substaat: aspireer die benodigde dosis van die oplossing met gesteriliseerde punte en moenie die oorblywende oplossing weer in die flessie gooi nie.TMB-substaat is sensitief vir lig, moenie TMB-substraat vir 'n lang tyd aan lig blootstel nie.

Gebruik protokol

1. Bepaal die aantal stroke benodig vir die toets.Plaas die stroke in die rame vir gebruik.Oorblywende plaatstroke wat nie in hierdie toets gebruik word nie, moet in die sak met droogmiddel herverpak word.Maak die sak styf toe vir verkoelde berging.

2. Voeg 100μL elk van verdunnings van standaard, blanko en monsters by die toepaslike putte.Bedek met die plaatseëlaar.Inkubeer vir 1 uur by kamertemperatuur met skud by 500rpm.Die monsters moet verdun word met STE buffer tot toepaslike konsentrasie vir akkurate bepaling.

3. Wasstap: Aspireer die oplossing en was met 250μL wasbuffer na elke put en laat dit vir 30 sekondes staan.Gooi wasbuffer heeltemal weg deur die plaat op absorberende papier te knip.Was heeltemal 4 keer.

4. Voeg 100μL van gebiotinileerde detectie-teenliggaampie-werkoplossing in elke put.Bedek met die plaatseëlaar.Inkubeer vir 1 uur by kamertemperatuur met skud by 500rpm.

5. Herhaal wasstap.

6. Voeg 100μL HRP-streptavidien-werkoplossing by elke put.Bedek met die plaatseëlaar.Inkubeer vir 30min by kamertemperatuur met skud by 500rpm.

7. Herhaal wasstap weer.

8. Voeg 100μL TMB-substraatoplossing by elke put.Bedek met die plaatseëlaar.Inkubeer vir 30 min by RT Beskerm teen lig.Die vloeistof sal blou word deur die byvoeging van substraatoplossing.

9. Voeg 50μL stopoplossing by elke put.Die vloeistof sal geel word deur die byvoeging van stopoplossing.Begin dan die mikroplaatleser en voer dadelik meting by 450nm uit.

Berekening van resultate

1. Gemiddeld die duplikaatlesings vir elke standaard, kontrole en monsters en trek die gemiddelde nul standaard optiese digtheid af.Konstrueer 'n standaardkromme met absorpsie op die vertikale(Y)-as en dsRNA-konsentrasie op die horisontale(X）-as).

2. Dit word aanbeveel om die berekening uit te voer met rekenaargebaseerde krommepassingsagteware soos curve expert 1.3 of ELISA Calc in 'n 5 of 4 parameter nie-lineêre pas model.

Optrede

1. Sensitiwiteit:

onderste limiet van opsporing: ≤ 0.001pg/μL (vir UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (vir 5-OMe-UTP-dsRNA).

onderste limiet van kwantifisering: 0,0156 pg/μL (vir UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (vir N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (vir 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Presisie: CV van Intra-toets ≤10%, CV van Inter-toets ≤10%

3. Herstel: 80%~120%

4.Lineariteit:0.0156-0.5pg/μL(virUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(virN1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL(vir 5-OMe-UTP-dsRNA).

Oorwegings

1. TMB reaksie temperatuur en tyd is van kritieke belang, beheer hulle asseblief volgens die instruksie streng.

2. Om goeie toetsreproduseerbaarheid en sensitiwiteit te bereik, is dit noodsaaklik om die plate behoorlik te was om oortollige ongereageerde reagense te verwyder.

3. Al die reagense moet deeglik gemeng word voor gebruik en vermy bulte tydens monster of reagense byvoeging.

4. As kristalle in die gekonsentreerde wasbuffer (20x) gevorm het, maak warm tot 37℃ en meng liggies totdat die kristalle heeltemal opgelos is.

5. Vermy ontleding van monsters wat natriumasied (NaN3) bevat, aangesien dit die HRP-aktiwiteit kan vernietig wat lei tot onderskatting van die hoeveelheid dsRNA.

6. Vermy RNase-kontaminasie tydens toetsing.

7. Die standaard/monster, opsporings-teenliggaampie en SA-HRP kan ook by RT uitgevoer word sonder om te skud, maar dit kan die opsporingsensitiwiteit eenvoudig laat afneem.Vir hierdie geval beveel ons aan dat UTP en pUTP dsRNA-standaarde verdun moet word vanaf 2pg/μL, N1-Me-pUTP dsRNA-standaarde moet verdun word vanaf 4pg/μL en 5-OMe-UTP dsRNA-standaard moet van 8pg/μL verdun word.Inkubeer ook HRP-streptavidien-werkoplossing vir 60 minute by kamertemperatuur.Moenie flesskudder gebruik nie, want flesskuder kan onakkurate resultate tot gevolg hê.

Tipiese resultaat

1. Standaard kurwe data

2. Standaardkrommeberekening

3. Voerbespeuringsreeks: 0,0312- 1pg/μL